Os ossos constituem um tecido metabolicamente ativo que sofre um processo contínuo de renovação e remodelação. Esta atividade é conseqüência, em sua maior parte, da atividade de dois tipos celulares principais, característicos do tecido ósseo: os osteoblastos e os osteoclastos. Um terceiro tipo celular, os osteócitos, derivados dos osteoblastos, são metabolicamente menos ativos e sua função é menos conhecida. O tecido ósseo exerce duas funções primordiais: uma mecânica, relacionada à proteção de órgãos nobres e apoio e sustentação contra a gravidade; e uma metabólica, bastante complexa e não menos importante.
No que diz respeito à função mecânica, ela é bem compreendida e, na realidade, afora o determinismo genético, a forma e a estrutura dos ossos são dimensionadas ativamente pela gravidade e pelas inserções musculares. Os estudos realizados em astronautas privados da força da gravidade mostraram claramente a importância do ambiente em que vivemos no dimensionamento da massa óssea.
Quanto à função metabólica, o tecido ósseo é a maior fonte de sais minerais e participa ativamente do equilíbrio eletrolítico do organismo como um todo. Os ossos estão em contínua remodelação, obedecendo a estímulos físicos e hormonais, sendo que estes últimos podem ser sistêmicos ou locais. Dentre os controles hormonais sistêmicos destacam-se o paratormônio e a vitamina D, que são os maiores responsáveis pela manutenção de níveis séricos estáveis de cálcio, fundamentais para inúmeras funções orgânicas.
Os dois principais tipos de tecido ósseo são o trabecular, uma estrutura de aspecto esponjoso; e o cortical, mais sólido e formado por lamelas ósseas. Além das diferenças estruturais, os dois tipos diferem também quanto a outros aspectos como a distribuição espacial das células, densidade da matriz mineralizada, distribuição dos vasos sanguíneos e medula óssea. Em ambos os tipos, os osteoblastos e osteoclastos movem-se livremente sobre a superfície, sendo que os osteoblastos podem tornar-se embebidos na matriz, dando origem aos osteócitos. Em função de sua maior superfície por volume, o osso trabecular é metabolicamente mais ativo que o cortical.
O processo de remodelação óssea se desenvolve com base em dois processos antagônicos mas acoplados: a formação e a reabsorção ósseas. O acoplamento dos dois processos é mantido a longo prazo por um complexo sistema de controle. Uma série de condições como idade, doenças osteometabólicas, mobilidade diminuída, ação de algumas drogas, etc. podem alterar este equilíbrio entre formação e reabsorção, levando ao predomínio de um sobre o outro, com conseqüências metabólicas (hiper ou hipocalcemia) e/ou mecânicas (osteoporose). (1)
Referência bibliográfica
1. Mundy GR. Bone Remodeling. In: Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 1999; 30-38.
Constituem-se no elemento básico de diagnóstico de qualquer doença osteometabólica. Apesar de serem dosagens de rotina em qualquer laboratório de Patologia Clínica, sua determinação merece uma série de considerações metodológicas.
Em primeiro lugar é preciso lembrar que ele circula sob duas formas principais, o cálcio ionizado (que exerce a ação biológica), e o cálcio ligado a proteínas e complexado. O primeiro corresponde, em circunstâncias normais, a 52% do total e o segundo, a 48%. É evidente que qualquer alteração do nível de proteínas séricas, em especial a albumina, leva a uma alteração do conteúdo total de cálcio no soro, sem que isto implique numa alteração da fração ionizada. Vale aqui o mesmo raciocínio desenvolvido quando se discute hormônios livres. Outro fator que leva a alterações das porcentagens ionizado/ligado é o pH, sendo que na acidose há uma tendência a uma menor ligação do cálcio às proteínas. Em vista disso, em uma série de circunstâncias clínicas, a dosagem de cálcio total não fornece informação fidedigna quanto à calcemia funcional. Além disto, devemos levar em conta aspectos práticos da dosagem de cálcio total no soro, mais disponível, que é usualmente feita por métodos colorimétricos, hoje automatizados e bastante confiáveis, sendo o método de referência o baseado em absorção atômica. Diversas equações foram advogadas para a correção dos valores do cálcio total no que se refere a alterações do conteúdo protéico, sendo a mais usada a proposta por McLean (1).
Com a maturação da tecnologia de determinação de cálcio ionizado com o emprego de eletrodos íon-específicos (2) ficou evidente, na prática, o maior poder diagnóstico dessa determinação, que deve ser a preferida, quando disponível. A dosagem de cálcio ionizado tem se mostrado extremamente útil, não só nos casos de hipercalcemia, mas também de hipocalcemia, que pode ser diagnosticada com rapidez e segurança, melhorando significativamente a qualidade do atendimento médico, em especial o de urgência. O único inconveniente em relação à determinação de cálcio ionizado se refere à coleta, pois o material deve ser tratado de maneira diferenciada. No caso das dosagens em sangue total, a coleta deve ser idealmente feita em seringas com heparina especial (titulada com cálcio para evitar quelação). No caso de dosagens séricas, o sangue deve ser colhido em tubo à vácuo, o soro separado rapidamente e, se for estocado, deve-se minimizar contato com ar, sendo que a amostra de soro deve ser congelada. O ideal é a realização imediata da dosagem, o que constitui outra vantagem adicional dos métodos íon-específicos, pois o resultado é obtido imediatamente. Os aparelhos mais modernos de determinação de cálcio ionizado medem concomitantemente o pH da amostra e fornecem o valor do cálcio ionizado medido e o corrigido para pH 7,4. Um aspecto adicional que merece cuidado é a definição de valores normais, em especial para os níveis de cálcio ionizado. Crianças apresentam valores mais altos que adultos e as faixas de normalidade podem variar de acordo com a metodologia empregada.
A excreção urinária de cálcio é de grande importância no diagnóstico e seguimento de inúmeras patologias ósteo-metabólicas. Do ponto de vista prático, pode ser expressa como valor absoluto de 24 horas ou, em relação ao filtrado glomerular, em amostra isolada. As duas formas de expressão da calciúria têm aplicações um tanto distintas. Assim, a excreção de 24 horas reflete o equilíbrio entre a absorção do cálcio da dieta e a perda ou ganho do esqueleto. Numa dieta normal em cálcio, a excreção de 24 horas tem como limite máximo 250 mg para o sexo feminino e 300 mg para o sexo masculino (3). Já a calciúria em amostra isolada deve ser coletada pela manhã, após 12 horas de jejum, desprezando-se a primeira micção e coletando nova amostra após 2 horas. Lembrar que o horário é importante porque será utilizado para cálculo do ritmo de filtração glomerular. A princípio, esta dosagem não é influenciada pela dieta, sendo uma representação bastante fidedigna da perda óssea de cálcio. O valor de referência é bastante discutido, mas o valor de 0,16 mg/dL de filtrado glomerular é o mais aceito.
O fósforo circula basicamente em duas formas: uma orgânica, composta principalmente de fosfolípides, e uma inorgânica, que é a usualmente medida e que em adultos apresenta uma concentração média de 4 mg/dL. Em função dos níveis de fósforo apresentarem variação importante com refeição e apresentarem um ritmo circadiano significativo, amostras devem ser coletadas de manhã e em jejum. Outro dado importante é o fato de que os níveis séricos de fósforo inorgânicos devem ser interpretados tendo-se em conta a faixa da normalidade referente à idade do paciente. Em crianças, a concentração é significativamente mais alta, estabilizando-se na idade adulta e apresentando discreto declínio na terceira idade. Já a excreção urinária de fósforo apresenta variações bastante significativas, sendo dependente principalmente da dieta. O valor limite de 1 grama por 24 horas é considerado como a referência superior da normalidade.
Referências bibliográficas
1. McLean FC, Hastings AB. The state of calcium in the fluids of the body I. The conditions affecting the ionization of calcium. J Biol Chem 1935; 108:285-322.
2. Bowers GN, Brassard C, Sena SF. Measurement of ionized calcium in serum with ion-selective eletrodes: a mature technology that can meet daily service needs. Clin Chem 1986; 32:1437-1447.
3. Bulusu L, Hodgkinson A, Nordin BEC, Peacock M. Urinary excretion of calcium and creatinine in relation to age and body weight in normal subjects and patients with renal calculi. Clin Sci 1970; 38:601-612.
A dosagem de PTH no soro tem uma longa história, iniciada, do ponto de vista de desenvolvimento metodológico, na década de 60. Este desenvolvimento da metodologia propiciou um maior conhecimento sobre o hormônio que, por sua vez, levou a novos desenvolvimentos metodológicos, e assim sucessivamente. Os primeiros métodos descritos eram ensaios carboxi-terminal específicos (1), que tinham como principal inconveniente o fato de que, por medirem uma fração hormonal cujo metabolismo depende diretamente da filtração glomerular, apresentavam elevações inespecíficas proporcionais às possíveis alterações de função glomerular. Além disso, a meia-vida longa desses fragmentos prejudicava seu uso em provas funcionais. A descrição de que a porção biologicamente ativa do PTH se concentrava nos 34 primeiros aminoácidos (porção amino-terminal) levou à dedução lógica que ensaios dirigidos para essa porção seriam os de melhor correlação clínica (2,3). O problema com os ensaios amino-terminais é a dificuldade de obtenção de anticorpos de afinidade suficiente para permitir a medida dos níveis de PTH nas condições fisiológicas normais. Apesar das dificuldades técnicas, este ensaio se mostrou superior aos ensaios carboxi-terminal específicos. Convém lembrar a utilidade de uma dosagem concomitante da creatinina e do cálcio séricos para a correta interpretação de uma dosagem de PTH, independentemente da metodologia empregada. As limitações dos radioimunoensaios amino-terminal específicos se prendem à sensibilidade, o que implica no emprego de alíquotas de soro ponderáveis e um tempo de execução longo além de, mesmo assim, não atingirem níveis ideais de sensibilidade. Isto dificultava o emprego de testes funcionais e a definição do diagnóstico etiológico nos casos de hipocalcemia a esclarecer e de hipercalcemia humoral maligna.
Atualmente, com a disponibilidade dos ensaios imunométricos (4), as metodologias foram bastante simplificadas e conseguiu-se uma uniformidade de resultados bastante aceitável, uma vez que, teoricamente, apenas a forma intacta do PTH, seqüência 1-84, é medida (5). Outra vantagem das novas metodologias é o alto grau de sensibilidade, o que trouxe um grande avanço no diagnóstico diferencial das hipercalcemias. Trabalhos recentes (6) mostraram que, além da forma 1-84, circulam formas de PTH que sofreram perda dos primeiros aminoácidos amino-terminais, gerando formas como o peptídeo 7-84. Interessante salientar que a atividade biológica do peptídeo é dependente da presença dos primeiros aminoácidos. Logo, pequenas deleções resultam em peptídeos inativos. Aparentemente, a presença dessas formas biologicamente inativas parece não ter grande importância diagnóstica, sendo o único cuidado atentar-se para os valores normais dos novos ensaios 1-84 específicos (que não cruzam com as formas 7-84), proporcionalmente mais baixos. Estudos adicionais são necessários para a melhor avaliação desses novos ensaios.
Um cuidado adicional que deve ser sempre lembrado quando da dosagem de PTH sérico se refere às condições de coleta. O PTH é um peptídeo de meia vida biológica bastante curta e extremamente frágil. Sua coleta requer condições especiais que incluem refrigeração logo após a coleta, centrifugação rápida, separação do soro e congelamento rápido. Caso estas condições não sejam seguidas, resultados falsamente baixos podem ser observados, com conseqüências importantes para o paciente.
Referências bibliográficas
1. Arnaud CD, Tsao HS, Littledike T. Radioimmunoassay of human parathyroid hormone in serum. J Clin Invest 1971; 50:21-34.
2. Vieira JGH, Oliveira MAD, Maciel RMB, Russo EMK. Development of an homologous radioimmunoassay for the synthetic amino terminal (1-34) fragment of human parathyroid hormone using egg yolk-obtained antibodies. J Immunoassay 1986; 7:57-72.
3. Vieira JGH, Oliveira MAD, Hidal JT, Russo EMK, Chacra AR. Análise crítica de dois radioimunoensaios segmento-específicos para a medida de paratormônio no diagnóstico de hiperparatiroidismo primário. Rev Ass Med Brasil 1988; 34:79-83.
4. Nussbaum SR, Zahradnik RJ, Lavigne JR, Brennan GL, Nozawa-Ung K, Kim L, Keutmann HT, Wang GA, Potts Jr JT, Segre GV. Highly sensitive two-site immunoradiometric assay of parathyrin and its clinical utility in evaluating patients with hypercalcemia. Clin Chem 1987; 33:1364-1367.
5. Vieira JGH, Nishida SK, Kasamatsu TS, Amarante EC, Kunii IS. Development and clinical application of an immunofluorometric assay for intact parathyroid hormone. Brazilian J Med Biol Res 1994; 27:2379-2382.
6. Brossard J-H, Cloutier M, Roy L, Lepage R, Gascon-Barré M, D'Amour P. Accumulation of a non-(1-84) molecular form of parathyroid hormone (PTH) detected by intact PTH assay in renal failure: importance in the interpretation of PTH values. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81:3923-3929.
Do ponto de vista prático, a 25 hidroxivitamina D (25OHD) e a 1,25 dihidroxivitamina D (1,25(OH)2D) são os únicos metabólitos da vitamina D que têm importância diagnóstica, em especial a dosagem de 25OHD. Isto porque o nível sérico da 25OHD é o melhor marcador da deficiência de vitamina D e da intoxicação exógena, razões mais freqüentes que levam à indicação de dosagem de metabólitos da vitamina D.
Ensaios para a medida de 25OHD sérica: os ensaios para a medida deste metabólito são basicamente de dois tipos: os competitivos, baseados no uso do esteróide marcado e uma proteína ligadora (1); e os baseados em cromatografia líquida de alta performance e leitura UV (2). Os do primeiro tipo, que podem se basear na proteína ligadora de vitamina D ou em anticorpos específicos, têm como vantagens a maior simplicidade, possibilidade de automação de processos e custos mais baixos. Já os do segundo tipo têm como vantagens a maior precisão e a possibilidade da medida das duas formas: o colecalciferol (D3) de origem endógena ou animal e o ergocalciferol (D2) de origem vegetal. O método mais utilizado atualmente são ensaios competitivos baseados em anticorpos específicos e marcadores não radioativos. Qualquer que seja o método empregado é fundamental uma definição precisa da faixa de normalidade, já que esta pode variar em diferentes populações em função de dieta, exposição solar e idade.
Ensaios para a medida de 1,25 (OH)2 D sérica: de todos os hormônios esteróides, a dosagem da 1,25 (OH)2 D é a que apresenta maiores dificuldades. Estas têm basicamente origem na instabilidade do esteróide e nas concentrações séricas, que são em média 1.000 vezes inferiores às da 25 OH D. Os métodos disponíveis baseiam-se em processos preparativos complexos e na determinação por ensaios competitivos baseados em receptores ou anticorpos específicos (3). A complexidade metodológica, associada à importância diagnóstica restrita, faz com que a dosagem de 1,25 (OH)2 D seja pouco disponível e bastante custosa.
Referências bibliográficas
1. Haddad JG, Chyu KJ. Competitive protein-binding radioassay for 25 hydroxycolecalciferol. J Clin Endocrinol Metab 1971; 33:992-995.
2. Eisman JA, Sheperd RM, DeLucca HF. Determination of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in human plasma using high-performance liquid chromatography. Anal Biochem 1977; 80:298-305.
3. Reinhardt TA, Horst RL, Orf JW, Hollis BW. A microassay for 1,25 dihydroxyvitamin D not requiring high performance liquid chromatography: application to clinical studies. J Clin Endocrinol Metab 1984; 958:91-98.
Avanços recentes no isolamento e na caracterização das células e dos componentes extracelulares da matriz óssea resultaram no desenvolvimento de métodos para a medida sérica ou urinária de novos marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo. Podemos definir marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo como substâncias que retratam a formação ou a reabsorção ósseas. Como a formação é dependente da ação dos osteoblastos, os marcadores de formação na realidade medem produtos decorrentes da ação destas células. Da mesma maneira, os marcadores de reabsorção medem a ação dos osteoclastos, o principal tipo celular envolvido na reabsorção da matriz óssea. No caso dos marcadores de formação, são todos eles frutos de síntese osteoblástica, enquanto os de reabsorção são produto da atuação do osteoclasto sobre a matriz óssea.
Normalmente, como o processo de formação é estreitamente ligado ao de reabsorção, um marcador que reflete reabsorção também reflete formação, isto quando o tecido ósseo está em equilíbrio, como durante o intervalo entre a terceira e a quinta décadas de vida. Durante o período de vida adulta, a atividade metabólica óssea e, conseqüentemente, os níveis dos marcadores tendem a ser mais baixos que os observados na infância e na adolescência (1). Apesar de não estarem plenamente documentados, poderíamos esperar que os marcadores de formação óssea fossem proporcionalmente mais elevados durante a infância e a adolescência do que os de reabsorção. Durante a gravidez e a lactação, o metabolismo ósseo também é mais acelerado, resultando em aumento dos níveis dos marcadores de formação e reabsorção (2). Nas mulheres após a menopausa, os marcadores também tendem a se elevar, com os marcadores de reabsorção apresentando um incremento maior que os de formação (3). Diferentemente, os níveis de marcadores permanecem estáveis no sexo masculino até a oitava década de vida (4).
Doenças ósseas alteram o padrão de produção dos marcadores bioquímicos. Doenças que levam à osteopenia tendem a aumentar a relação entre os marcadores de reabsorção e os de formação, como parece ser o caso da osteoporose (3). Por outro lado, em condições patológicas como a osteopetrose espera-se um incremento maior dos marcadores de formação. Além disto, os marcadores de formação óssea atualmente em uso refletem a atividade osteoblástica em diferentes estágios de diferenciação deste tipo celular. Durante a formação do osso, a produção da matriz colágena precede a mineralização. A fase de produção de matriz colágena coincide com uma maior produção de fosfatase alcalina, enquanto a mineralização coincide com uma maior produção de osteocalcina (5). Conseqüentemente, doenças que alteram a diferenciação osteoblástica tendem a alterar a relação entre os marcadores de formação. Tal fenômeno pode ser observado na doença de Paget, na qual o aumento dos níveis de fosfatase alcalina óssea é proporcionalmente bem maior que os de osteocalcina, sugerindo uma alteração na diferenciação dos osteoblastos (6). Os estados de deficiência de vitamina D também são caracterizados por uma alteração na diferenciação dos osteoblastos, daí o desproporcional aumento dos níveis de fosfatase alcalina encontrados na osteomalácia (7).
Os principais marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo atualmente em uso estão listados na Tabela I, divididos entre os que refletem formação e os que refletem reabsorção. Um importante aspecto que deve ser salientado é a grande variabilidade que os marcadores apresentam dia a dia, em especial quando medidos em urina, onde podem chegar a 30% num mesmo indivíduo em condições basais (8). Logo, para que variações induzidas pela introdução de terapêutica específica tenham significado, são necessárias variações acima desses limites.
Outros fatores também podem interferir nos níveis dos marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo, independentemente de alterações na remodelação de longa duração. Assim, a remodelação óssea apresenta um ritmo circadiano, com maiores níveis durante a noite (9). Em função disto, a primeira urina da manhã, ou amostra de soro coletada nesse horário, reflete o pico de reabsorção óssea e apresentará valores seguramente mais altos que uma amostra colhida em outro horário. Quanto aos marcadores séricos de formação, um aspecto importante a considerar na indicação e na interpretação dos valores é a significativa diferença de meia-vida biológica entre fosfatase alcalina óssea (em torno de 1,6 dias) e osteocalcina (menos de uma hora). Logo, fenômenos agudos são melhor representados pelos níveis de osteocalcina, enquanto os níveis de fosfatase alcalina óssea são mais estáveis e reprodutíveis.
Adicionalmente, os níveis de marcadores bioquímicos, principalmente os de formação, variam ao longo do ciclo menstrual, sendo mais elevados durante a fase lútea comparativamente à fase folicular (10). Alterações importantes de função renal também podem interferir significativamente no metabolismo e na excreção dos marcadores bioquímicos, principalmente da osteocalcina.
Em função de todos os aspectos discutidos, a interpretação correta de valores de marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo requer conhecimento das condições de coleta da amostra, bem como da condição geral do paciente.
Formação | Reabsorção |
|---|---|
Fosfatase alcalina óssea e/ou total (soro) | Hidroxiprolina (urina) |
| Osteocalcina (soro) | Interligadores do colágeno - cross-links (urina e soro) |
| Propeptídeos do colágeno tipo 1 (soro) | Piridinolinas totais |
| Piridinolina e/ou deoxipiridinolina livre | |
| N-telopeptídeo (NTX) | |
| C-telopeptídeo (CTX) | |
| Fosfatase ácida tartrato-resistente (soro) |
Esta enzima é codificada pelo gen, tecido não-específico, AlP, localizado no cromossomo 1. A isoenzima óssea é um peptídeo de 507 aminoácidos, cuja seqüência é exatamente igual à da isoenzima hepática. A diferença entre elas se dá na glicosilação, um fenômeno pós-tradução. Em condições normais, as duas formas predominantes em circulação (>90% do total) de fosfatase alcalina são a óssea e a hepática, em quantidades equivalentes. A outra forma circulante, em concentrações significativas, é a forma intestinal, que representa menos de 5% do total. A fosfatase alcalina é uma ectoenzima, ou seja, está localizada na superfície externa da célula, onde exerce sua atividade. Quando ancorada na superfície celular, a enzima está na forma de um tetrâmero, sendo que quando liberada para a circulação, por ação da fosfolipase C e D, o é na forma dimérica. No caso da isoenzima óssea, a atividade exercida é mal definida. As alterações encontradas na hipofosfatasia, doença devida a uma mutação no gen codificador da enzima, predominantemente osteomalácia, sugerem fortemente que a enzima tenha papel fundamental na mineralização. Durante muitas décadas, a medida da atividade total de fosfatase alcalina foi a base do estudo de patologias tanto ósseas como hepáticas, partindo-se do pressuposto que o aumento da atividade total seria devido à isoenzima específica da patologia. Em linhas gerais este raciocínio é válido, com o inconveniente óbvio da perda de sensibilidade e especificidade que esta condição acarreta. Inúmeros métodos foram descritos com o intuito de separar a atividade das duas isoenzimas, sendo os mais empregados a inativação térmica e a precipitação específica com lectinas (11). Com a descrição recente de anticorpos monoclonais específicos para a enzima óssea (12), alguns métodos específicos foram descritos, dos quais dois merecem maior atenção: um baseado na captura específica da enzima e posterior revelação por sua atividade enzimática intrínseca (13) e o outro, um ensaio imunométrico de dupla identificação (14). A reatividade cruzada com fosfatase alcalina hepática é, nos dois métodos, em torno de 15% e não existem estudos que mostrem superioridade de um método sobre o outro. Um aspecto relativo ao uso e interpretação dos valores de fosfatase alcalina óssea é o fato de que eles não aumentam exclusivamente com o aumento da formação óssea, mas também na osteomalácia. Esta observação torna a enzima um marcador do tratamento da osteomalácia com vitamina D.
A osteocalcina é um peptídeo secretado pelos osteoblastos maduros, condrócitos hipertrofiados e odontoblastos. Apesar de ser primariamente depositada na matriz óssea recém-formada, uma pequena fração entra em circulação, caracterizando esta pequena proteína como marcador da atividade do osteoblasto. Apesar de ser depositada em quantidades significativas na matriz óssea sendo uma das proteínas não-colágenas mais abundantes, não é um marcador de reabsorção óssea, pois é totalmente destruída quando da reabsorção promovida pelos osteoclastos. A osteocalcina é constituída por 49 aminoácidos, sendo três (posições 17, 21 e 24) constituídos por ácido gama-carboxi-glutâmico (Gla), o que lhe dá a peculiaridade de ligar cálcio. A função ou funções da osteocalcina é ou são ainda mal definidas, apesar de sua estrutura indicar interação com cálcio e com cristais de hidroxiapatita. Adicionalmente, estudos indicam que o aparecimento e o aumento de produção da proteína são coincidentes com o início do processo de mineralização, sendo pois sua produção um marcador do osteoblasto maduro (15). Outros estudos in vitro e in vivo sugerem que a osteocalcina tenha importante papel no recrutamento e na diferenciação dos osteoclastos (16). A osteocalcina circula em diferentes formas moleculares, que incluem a forma intacta 1-49 (36%), um fragmento amino-terminal grande 1-43 (40%) e fragmentos menores (aa 1-19, 20-43, 29-49, 34%) (17). A excreção destes diferentes peptídeos depende da integridade da função renal, de maneira que mesmo pequenas disfunções renais podem levar a aumentos diferenciados das diferentes formas circulantes. O fato de várias formas de osteocalcina serem encontradas normalmente no soro e da metabolização de algumas ser dependente da integridade da função renal traz um complicador significativo para os métodos de medida do nível de osteocalcina sérica. Esta é uma razão pela qual os estudos comparativos entre métodos radioimunológicos mostraram diferenças significativas entre eles, independentes do padrão de referência empregado (18). O desenvolvimento de ensaios imunométricos baseados em anticorpos monoclonais tornou os resultados das dosagens com diferentes métodos mais comparáveis (19,20). No entanto, a interpretação dos níveis de osteocalcina deve levar em consideração uma série de fatores, desde a metodologia empregada, até as condições de coleta, já que o peptídeo é susceptível a proteólise e deve ser coletado e manipulado com cuidados especiais para evitar a degradação. Adicionalmente, os níveis de osteocalcina também observam ritmo circadiano, com valores decrescentes durante a manhã, que começam a subir lentamente à tarde, atingindo o pico em torno de meia-noite (21). Uma observação adicional, e que comprova o fato de que a osteocalcina mede atividade osteoblástica em estágio diferente da medida pela fosfatase alcalina óssea, é o fato da correlação entre as duas medidas ser bastante baixa (22).
A excreção urinária de hidroxiprolina é um marcador clássico da reabsorção óssea, tendo sido usado durante décadas em pesquisa e diagnóstico. No entanto, o fato da hidroxiprolina não ser limitada ao osso, nem mesmo ao colágeno, contribuiu muito para o seu gradual abandono como exame de referência. De fato, o componente C1q do complemento é rico em hidroxiprolina e pode contribuir com até 40% do total excretado. Além disto, a excreção é dependente da dieta, já que alguns alimentos comuns (que contêm gelatina) podem contribuir significativamente para o pool de aminoácido excretado (17). Desta maneira, com o desenvolvimento dos métodos mais específicos para avaliação da reabsorção óssea, a medida de hidroxiprolina tem sido abandonada e considerada obsoleta.
Durante a maturação do colágeno, as fibrilas recém-depositadas na matriz extracelular são estabilizadas pela interligação entre radicais lisina e hidroxilisina de diferentes cadeias. Assim, por ação da enzima lisil oxidase, moléculas de lisina e hidroxilisina da porção terminal (telopeptídeos) das moléculas de colágeno formam aldeídos e se condensam com resíduo de molécula adjacente, formando uma estrutura interligadora composta de três radicais hidroxilisina (piridinolina) ou uma lisina e duas hidroxilisinas (deoxipiridinolina). As piridinolinas atuam como interligadores (cross-links) nos colágenos tipo I, II e III, os principais de todos os tecidos com exceção da pele (23). As proporções piridinolina:deoxipiridinolina variam de acordo com o tipo de colágeno, sendo menores no colágeno tipo I. Quando os osteoclastos reabsorvem o tecido ósseo, eles o fazem pela secreção de uma mistura de proteases ácidas e neutras que, agindo seqüencialmente, degradam as fibrilas colágenas em fragmentos de diferentes tamanhos. Os produtos de degradação que são jogados em circulação variam desde aminoácidos livres até fragmentos carboxi e amino-terminais contendo interligadores (C e N-telopeptídeos). Os fragmentos liberados pelos osteoclastos são adicionalmente metabolizados pelo fígado e pelos rins, de maneira a resultar em fragmentos suficientemente pequenos para serem excretados pelos rins por simples filtração glomerular.
As piridinolinas, livres ou ligadas a fragmentos amino ou carboxi-terminais, têm uma série de vantagens sobre a hidroxiprolina como marcadores de reabsorção óssea. Elas só se originam de fibrilas colágenas extracelulares e maduras. Os peptídeos amino ou carboxi-terminais têm seqüências características do colágeno de onde se originaram (ex. colágeno tipo I) e, apesar de estarem presentes na dieta, aparentemente não são absorvidos. As metodologias existentes para a medida dos interligadores do colágeno evoluíram bastante nos últimos anos. Os primeiros métodos descritos foram os baseados em técnicas de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) e medem simultaneamente a piridinolina e a deoxipiridinolina totais (24,25). Estes métodos implicam em hidrólise prévia das amostras e se baseiam na detecção das piridinolinas com base em sua fluorescência natural. Foram aplicados extensivamente, inclusive em nosso meio (26), e apresentam boa reprodutibilidade. No entanto, são métodos muito laboriosos, demorados e bastante caros, daí a procura por metodologias alternativas, mais rápidas, práticas e baratas. Dentre as alternativas disponíveis destacam-se os métodos imunológicos baseados em anticorpos específicos contra as estruturas dos interligadores. Podemos classificá-los em três tipos:
a. os baseados em anticorpos contra as piridinolinas livres (piridinolina e/ou deoxipiridinolina);
b. os baseados em anticorpo que reconhece a seqüência que inclui os interligadores N-terminais (N-telopeptídeo);
c. os baseados em anticorpos dirigidos contra a seqüência que inclui os interligadores C-terminais (C-telopeptídeo).
Inúmeros trabalhos têm sido publicados na literatura recente, procurando demonstrar algum tipo de vantagem de uma metodologia em relação a outra. A análise conjunta dos trabalhos mostra que, se existe superioridade de algum dos três ensaios em relação aos outros, esta é bastante marginal. Poderíamos considerar que qualquer um dos três é um bom método para estudar a reabsorção óssea, sendo os métodos de escolha no momento aqueles baseados em amostras de soro, devido à menor variabilidade.
Utopicamente, o marcador bioquímico ideal seria aquele que nos permitiria discriminar qual o paciente que se beneficiaria de tratamento preventivo contra a osteoporose e, adicionalmente, permitiria avaliar precocemente o grau de resposta à terapêutica introduzida. Quanto ao primeiro item, trabalhos recentes correlacionaram o início da menopausa com o aumento significativo dos marcadores bioquímicos e demonstraram que este aumento estaria relacionado com a posterior perda de massa óssea (27,28). Desta forma, seria possível discriminar as pacientes que evoluiriam com perda óssea aumentada daquelas que apresentariam perda óssea dentro dos limites normais para a idade e a condição hormonal. Neste sentido, todos os marcadores bioquímicos mostraram-se úteis, com possível vantagem para os interligadores de colágeno. Vale salientar que estes e outros estudos (27-30) mostram resultados válidos quando analisados em conjunto, ou seja, população com perda óssea contra população sem perda óssea. A transferência dessas informações para o caso individual é muitas vezes difícil, se não impossível. Quanto ao segundo item, ou seja, se os marcadores bioquímicos poderiam servir como sinalizadores precoces do sucesso ou insucesso de uma determinada terapia, muitas evidências indicam que sim. A necessidade neste caso seria de um marcador mais precoce de ação terapêutica, já que os efeitos retratados por mudanças na densitometria óssea são discerníveis apenas a longo prazo (mais de um ano). É consenso atualmente que os marcadores bioquímicos preenchem tal necessidade, independentemente do tipo de terapêutica empregada (8,31,32). Os marcadores de reabsorção aparentemente respondem mais rapidamente ao tratamento com alendronato (um mês) que os de formação (três meses), mas a informação final é equivalente (8). Tal resposta permite ao médico assistente uma intervenção precoce na conduta terapêutica, de maneira a otimizar os resultados sem necessidade de esperar pelas alterações densitométricas que ocorrerem a longo prazo. Importante salientar que a variação nos níveis do marcador bioquímico aceita como significativa depende das variações intra-individuais intrínsecas de cada um, como já referido acima. Assim, os marcadores urinários de reabsorção necessitam de variações acima de 30% para serem consideradas significantes, enquanto que as variações dos marcadores séricos de formação e de reabsorção podem ser menores, na faixa de 15 a 20%.
1. Rauch F, Schonau E, Woitge H, et al. Urinary excretion of hydroxy-piridinium cross-links of collagen reflects skeletal growth velocity in normal children. Exp Clin Endocrinol 1994; 102:94-97.
2. Sowers M, Eyre D, Hollis BW, et al. Biochemical markers of bone turnover in lactating and nonlactating postpartum women. J Clin Endocrinol Metab 1995; 80:2210-2216.
3. Kushida K, Takahashi M, Kawana K, Inoue T. Comparison of markers for bone formation and resorption in premenopausal and postmenopausal subjects and osteoporotic patients. J Clin Endocrinol Metab 1995; 80:2447-2450.
4. Wishart JM, Need AG, Horowitz M, et al. Effect of age on bone density and bone turnover in men. Clin Endocrinol (Oxf) 1995; 42:141-146.
5. Stein GS, Lian JB. Molecular mechanisms mediating proliferation/differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype. Endocrin Rev 1993; 14:424-442.
6. Alvarez L, Guanabens N, Pens P, et al. Discriminative value of biochemical markers of bone turnover in assessing the activity of Paget's disease. J Bone Miner Res 1995; 10:458-465.
7. Demiaux B, Arlot ME, Chapuy MC, et al. Serum osteocalcin is increased in patients with osteomalacia: correlations with biochemical and histomorphometric findings. J Clin Endocrinol Metab 1992; 74:1146-1151.
8. Garnero P, Shih WJ, Gineyts E, et al. Comparison of new biochemical markers of bone turnover in late popstmenopausal osteoporotic women in response to alendronate treatment. J Clin Endocrinol Metab 1994; 79:1693-1700.
9. Sarainen S, Tahtela R, Laitinen K, et al. Nocturnal rise in markers of bone resorption is not abolished by bedtime calcium or calcitonin. Clacif Tissue Int 1994; 55:349-352.
10. Nielsen HK, Brixen K, Bouillon R, Mosekilde L. Changes in biochemical markers of osteoblastic activity during the menstrual cycle. J Clin Endocrinol Metab 1990; 70:1431-1437.
11. Farley JR, Hall SL, Herring S, et al. Reference standards for quantification of skeletal alkaline phosphatase activity in serum by heat inactivation and lectin precipitation. Clin Chem 1993; 39:1878-1884.
12. Hill CS, Wolfert RL. The preparation of monoclonal antibodies which react preferentially with human bone alkaline phosphatase and not liver alkaline phosphatase. Clin Chim Acta 1989; 186:315-320.
13. Gomez Jr B, Ardakani S, Ju J et al. Monoclonal antibody assay for measuring bone-specific alkaline phosphatase activity in serum. Clin Chem 1995; 41:1560-1566.
14. Garnero P, Delmas PD. Assessment of the serum levels of bone alkaline phosphatase with a new immunoradiometric assay in patients with metabolic bone disease. J Clin Endocrinol Metab 1993; 77:1046-1053.
15. Owen TA, Aronow M, Shalhoub V et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol 1990; 143:420-430.
16. Chenu C, Colucci S, Grano M et al. Osteocalcin induces chemotaxis, secretion of matrix proteins and calcium-mediated intracellular signaling in human osteoclast-like cells. J Cel Biol 1994; 127:1149-1158.
17. Delmas PD. Biochemical markers of bone turnover I: theoretical considerations and clinical use in osteoporosis. Amer J Med 1993; 95:11S-16S.
18. Delmas PD, Christiansen C, Mann KG, Price PA. Bone gla protein (osteocalcin) assay standardization report. J Bone Min Res 1990; 5:5-10.
19. Garnero P, Grimaux M, Demiaux B, et al. Measurement of serum osteocalcin with a human specific two-site immunoradiometric assay. J Bone Miner Res 1992; 7:1389-1398.
20. Hosoda K, Eguchi H, Nakamoto T, et al. Sandwich immunoassay for intact human osteocalcin. Clin Chem 1992; 38:2233-2238.
21. Nielsen HK. Circadian and circatrigintan changes in osteoblastic activity assessed by serum osteocalcin. Dan Med Bull 1994; 41:216-227.
22. Diaz Diego EM, Diaz Martin MA, de la Piedra C, Rapado A. Lack of correlation between levels of osteocalcin and bone alkaline phosphatase in healthy control and postmenopausal osteoporotic women. Horm Metabol Res 1995; 27:151-154.
23. Eyre D. Collagen cross-linking amino acids. Methods Enzymol 1987; 144:115-136.
24. Eyre DR, Koob TJ, Van Nees KP. Quantitation of hydroxypiridinium crosslinks in collagen by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem 1984; 137:380-388.
25. Uebelhart D, Gineyts E, Chapuy MC, Delmas PD. Urinary excretion of pyridinium crosslinks: a new marker of bone resorption in metabolic bone disease. Bone Miner 1990; 8:87-96.
26. Amarante ECJ, Kasamatsu TS, Kunii IS, Vieira JGH. Avaliação da excreção urinária de piridinolina e deoxipiridinolina em pacientes com hipertiroidismo e sua correlação com níveis de hormônios tiroidianos e densidade mineral óssea. Arq Bras Endocrinol Metab 1996; 40:258-263.
27. Garnero P, Sornay-Rendu E, Chapuy M, Delmas PD. Increased bone turnover in late menopausal women is a major determinant of osteoporosis. J Bone Miner Res 1996; 11:337-349.
28. Schlemmer A, Hassager C, Delmas PD, Christiansen C. Urinary excretion of pyridinium cross-links in healthy women; the long term effects of menopause and oestrogen/progesterone therapy. Clin Endocrinol (Oxf) 1994; 40:777-782.
29. Eastell R, Robins SP, Colwell T et al. Evaluation of bone turnover in type I osteoporosis using biochemical markers specific for both bone formation and bone resorption. Osteoporos Int 1993; 3:255-260.
30. Seibel MJ, Cosman F, Shen V et al. Urinary hydroxypyridinium crosslinks of collagen as markers of bone resorption and estrogen efficacy in postmenopausal osteoporosis. J Bone Miner Res 1993; 8:881-889.
31. Adami S, Passeri M, Ortolani S et al. Effects of oral alendronate and intranasal calcitonin on bone mass and biochemical markers of bone turnover in postmenopausal osteoporosis. Bone 1995; 17:383-390.
32. Bikle DD. Biochemical markers in the assessment of bone disease. Am J Med 1997; 103:427-436.